به کارگیری منحنی های شکنندگی در ارزیابی آسیب پذیری لرزهای اسکله های شمع و عرشه

اختصاصی از زد فایل به کارگیری منحنی های شکنندگی در ارزیابی آسیب پذیری لرزهای اسکله های شمع و عرشه دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

محل انتشار: دهمین کنگره بین المللی مهندسی عمران تبریز

تعداد صفحات: 8

نوع فایل : pdf

تحلیل اثر روش تعیین موقعیت قله منحنی پراش در اندازه گیری تنش پسماند به روش استاندارد پراش اشعه ایکس

اختصاصی از زد فایل تحلیل اثر روش تعیین موقعیت قله منحنی پراش در اندازه گیری تنش پسماند به روش استاندارد پراش اشعه ایکس دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

همه چیز در مورد ارتینگ

اختصاصی از زد فایل همه چیز در مورد ارتینگ دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

چندین فایل متنی و تصویری -بسیار بسیار مفید و کاربردی ارتینگ جهت استفاده مجریان و ناظران و طراحان تاسیسات برق و خصوصا ساختمان تعریف –انواع زمین کردن-طرح اصولی زمین کردن-اشنایی با انواع سیستم های صاعقه گیر و محاسبات و..- روش مش و..-مقاومت ویژه و نیزاندازه گیری مقاومت ویژه خاک-انواع روشهای مقاومت زمین- روشهای کاربردی اجرای چاه ارت و نیز انواع سیستم های ارت-بررسی عوامل موثر بر مقاومت-جوش انفجاری و روشهای آن-تقسیم بندی انواع سیستمهای ارتینگ و بررسی تخصصی آنها-بتونیت- بررسی همبندی بصورت کاملا اجرایی و کاربردی-و... هر انچه که در مورد ارتینگ لازم داشته با شید.

دانلود مقاله بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها

اختصاصی از زد فایل دانلود مقاله بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) برای تشخیص کریپتوسپوریدیا در انسان ها

خلاصه :
کریپتوسپوریدیایی انسان ها یک بیماری روده ای است که معمولاً به علت عفونت در cryptosporidium hominis یا c-parvum به وجود می آید . این بیماری بیشتر از راه دهان – مدفوعی منتقل می شود (آب یا غذا) و اثر اجتماعی – اقتصادی عمده ای در جهان دارد .
عامل اصلی در پیشگیری ، مراقبت و کنترل کریپتوسپوریدیایی ، تشخیص و ویژگی ژنتیکی گونه های عمده و گوناگونی جمعیت ( که ژنوتیپ یا subgenotye هم خوانده می شود ) کریپتوسپوریدیای منتقل شده به انسان است به خصوص اینکه در حال حاضر هیچ شیمی درمانی موثر ضد کریپتوسپوریدیا یا واکسنی وجود ندارد . در این تحقیق ، ما با استفاده از دومین جدا کننده رونویسی داخلی (ITS-2) DNA ریبوزومی هسته ای به عنوان نشانه ژنتیکی ، روش بررسی منحنی ذوب با تفکیک بالا (HRM) واکنش زنجیره ی پلیمری جفت شده را برای تشخیص سرایت c-parvum, Cryptosporidium hominis یا c.meleagridis بنا کردیم . یک ارزیابی از منحنی ، تغییر پذیرهای داخلی کوچکتر از %1.5 و تغییر پذیری های معیاری داخلی کوچکتر از %3.5 را معلوم کرد . c.parvum , Cryptosporidium hominis و c.meleagridis با استفاده از 143 نمونه DNA ی انگل های کریپتوسپوریدیم که از استرالیایی های مبتلا به کریپتوسپوریدیا گرفته شده به ترتیب در سال های 2,44,97 کشف شدند . منحنی های ذوبی که با حداکثر دمای c°33/0 ± 47/72 درجه و c°45/0 ± 19/74 درجه سانتی گراد ( نمودار1) ، c°32/0 ± 17/72 (نمودار 2) و c°03/0 ± 33/73 (نمودار3) مشخص می شوند به طور ژنتیکی به ترتیب به عنوان c.hominis c.parvum , و c.meleagridis شناخته می شوند . در نتیجه ، بررسی ذوب PCR جفت شده ی ITS-2 باعث تشخیص c.hominis c.parvum , و c.meleagridis شد . این راه مناسب ترین راه برای آزمایش سریع تعداد زیادی از نمونه های DNA ی انگلی کریپتوسپوریدیم است و اگر چه کیفی است نسبت به بررسی الکتروفورتیک به طور قابل توجهی زمان کمتری برای اجرا می گیرد و مزیت افزوده ذخیره ی اطلاعات و قابلیت آنالیز در سیلیکو را نیز دارا می باشد . این روش ابزار مناسبی برای بررسی همه گیری و شیوع کریپتوسپوریدیا را در اختیار می گذارد و قابل اجرا برای انواع دیگر کریپتوسپوریدیا به جز آن هایی که در این جا بررسی شد ، می باشد .

1. مقدمه :
کریپتوسپوریدیای انسانی معمولاً یک بیماری روده ای است که توسط انواع کریپتوسپوریدیا ایجاد می شود و به وسیله راه های دهانی – مدفوعی منتقل می شود [1] . این بیماری به طور ناگهانی اتفاق می افتد [2و3] اما عموماً به دوران کودکی – مراکز مراقبت مربوط می شود و از استخرهای شنا یا آب های نوشیدنی منابع سرایت می کند . [4-9] . بحث دوم که مهم است ، این است که انگل های اولیه Cryptosporidium در مقابل مواد ضد عفونی کننده مثل کلر که عموماً برای پاکسازی آب استفاده می شود ، مقاوم هستند [10-12] . شیوع های از راه آب که از کشورهای توسعه یافته مثل آمریکا و کانادا گزارش شده اند و قابل توجه ترین آن که در سال 1993 در Milwaukee اتفاق افتاد منجر به 5000 مورد تایید شده و بیش از 400،000 مورد مشکوک به کریپتوسپوریدیا شد [4و5و13و14] . به علت حالت جهندگی انگل ها در آب و محیط [15] ، هزینه نسبتاً بالا و دسترسی محدود به ترکیبات شیمیایی یا رژیم های درمانی یا واکسیناسیون در انسان ها و دیگر حیوانات [16-20] و اثر اجتماعی – اقتصادی آن ( مخصوصاٌ در جوامع انسانی که در آن ایدز / HIV شایع است ) . کریپتوسپوریدیا توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) به عنوان یک عامل بیماری زا که کیفیت آب را نشان می دهد ، رده بندی شد [12] . تشخیص قاطع کریپتوسپوریدیا در انسان ها که شامل شناسایی و تشریح خصوصیات انواع کریپتوسپوریدیا است ، عامل اصلی در کنترل این بیماری و فهمیدن عواقب همه گیری آن است . محدودیت های قابل توجهی با بکارگیری روش های سنتی ، میکروسکوپی ، بیوشیمیایی و سرم خونی برای تشخیص قاطع وجود داشته اند به طوری که ابزارهای ژنتیکی – مولکولی پیشرفته شناسایی و توسعه یافته اند [22] . با استفاده از این ابزارها در حال حاضر ، بیش از 18 نوع کریپتوسپوریدیا و تعداد زیادی ژنوتیپ شناخته شده است [6و23و24] که c.hominis و c.parvum نوع غالب آن ها هستند و در انسان ها پر اهمیت ترین هستند ( به جز تعداد معدودی ، بقیه انواع هم اغلب به این دسته تعلق دارند ) ( مثل [26-28] ) . ابزارهایی که بر مبنای وواکنش زنجیره ی پلیمری (DCR) هستند به طور گسترده ای به کار گرفته شده اند ، چون حساسیت آنها گسترش خاصی از مکان ژنتیکی را از مقدار ناچیزی از مواد انگلی مجازی دارد [29] . مکان های مختلف که شامل واحد تبعی کوچکی [667] از فضاگیرهای RNA ریبوزومی هسته ای و DNA ی ریبوزومی (rDNA) ، پروتئین چسبناک مربوط به ترومبوسپونوین (trop) ، پروتئین شوک حرارتی (hsp70) 70KDa و ژن های پروتئین دیواره انگلی کریپتوسپوریدیا (cowp) می شود ، برای شناسایی و اختلاف بین انواع کریپتوسپوریدیا و متغییرهای ژنتیکی ( ژنوتیپ و ژنوتیپ وابسته) به کار گرفته می شوند [22] . اخیراً ، PCR جفت با روش های پویش جهشی الکتروفوز ترکیب شده با زنجیره ی DNA ، برای این هدف به کار گرفته می شوند [30-31] . برای مثال ، برای غلبه بر محدودیت هایی که در آنالیز تغییر پذیری متوالی در حین فرآورده های PCR وجود داشت پولیمر فسیم ( چند ریختی بودن ) ترکیبی تک استانداردی (sscp) ، برای نمایش مستقیم اختلاف ژنتیکی در hsp70 , SSU و دومین فضاگیر داخلی رونویسی (ITS – 2) هسته ای rDNA ی c.hominis و c.parvum معین شدند [30-36] . مزیت های این روش های الکتروفورزی (مثل خاص بودن ، حساسیت و قابلیت تکثیر کم و زیاد ) از میان نتایجی که از مقایسه مستقیم یک روش SSCP با تعدادی از روش های مختلف مولکولی که برای توصیف ویژگی های ژنتیکی یک نوع کریپتوسپوریدیای انتخاب شده بدست آمد ، اثبات شد [37] . اگرچه این روش بسیار مفید و موثر است ولی آنالیز الکتروفورزی ، در بعضی موارد ، می تواند وقت گیر باشد .
به علت نیاز افزوده به تشخیص با بازده بالا و بررسی ژنتیکی عامل بیماری و نیز جا به جایی اطلاعات ، بررسی ذخیره سازی در سیلیکو ، توجه قابل ملاحظه ای روی ارزیابی و گسترش روش های مرور جهش وجود داشته است که به مشخصه های ذوب امپلیکن ها و آنالیز الکتروفورزی گریزی وابسته است . این روش که خصوصاً برای آنالیز منحنی ذوب با تکنیک بالا (HRM) و منحنی ذوب مبتنی بر RCR به کار می رود ( مثال [38-41] ) و به طور قابل توجهی زمان مورد نیاز برای آزمایش را کاهش می دهد ، می تواند به سرعت بالای آشکارسازی جهش برای امپلیکن های کوچک ( معمولاً bp100 تا 250) برسد [42 تا 45] و منجر به نتایج کیفی و کمی شود . [38و46-49] . در این تحقیق ، روش کاربردی آنالیز منحنی ذوب PCR جفت شده ارزیابی و بنا شد ، ITC – 2 به عنوان ژنتیک ساز برای آشکارسازی نوع غالب کریپتوسپوریدیای سرایت شده به انسان به کار گرفته شد و در مورد دلایل این روش تشخیصی- مولکولی بحث شد .
2- مواد و روش ها
2.1 نمونه ها و جداسازی DNA ژنومی
نمونه های مدفوعی (143 =n) از بیماران مبتلا به کریپتوسپوریدیا از استرالیا جمع آوری شدند . تشخیص کوپرولوجیکی کریپتوسپوریدیا بر اساس آشکارسازی انگل ها با استفاده از روش لکه دار کردن اصلاح شده ذیل – نیلسن ایجاد شده [50] . DNA ژنومی همان طور که توسط مورگان و دیگران توصیف شده از نمونه های مدفوعی استخراج شد [51] . در اصل ، نمونه های مدفوعی فردی در محلول نمک بافر فسفات (PBS) معلق بودند (1:4) . سوسپانسیون ( محلول ) یکدست و یکنواخت شده و lµ20 از آن بیرون کشیده شد و به lµ80 از (pvpp) (sigma) پلی پیرولیدرن پلی دینل %10 معلق در H2O اضافه شد . بعد از اضافه شدن PVPP ، نمونه ها برای 10 دقیقه در دمای c°100 حرارت دیدند و سپس برای 30 ثانیه در kg 10،000 سانتریفیوژ شدند . بعد از سانتریفیوژ ، هر یک از ذرات شناور به یک لوله جدید منتقل شد و کل DNA با استفاده از mini-column (Qiagen,copro-kit,Germany) براساس دستورالعمل سازنده جداسازی شد . نمونه های DNA ژنومی قبلاً براساس PCR ترتیب دهی شده با SSCP لوسی با SSU یا ژن گلیکو پرتئین KDa60 (gp60) به انواع مختلف طبقه بندی شد [30 و 31] .

2.2 . توسعه آنزیمی و آنالیز منحنی ذوب :
ناحیه ی ITS-2 ( bp440 450 ، شامل توالی جانبی ) PCR ای بود که با استفاده از پریمرهای AP58SF (مستقیم : 5'-ATC TCT CAA GCG AAA TAG CAG TAA-3') و APITS-2R
(معکوس: 5'-CCC ATT GAT AAA CGG ATT TCC-3') از نمونه های DNA ژنومی فردی تقویت شد و خصوصاً به ترتیب برای 5.85 زنجیره های ITS-2 rDNA ی محدوده ای از انواع کریپتوسپوردیا ( اعداد افزایشی AF093012 , AF093008 , AF015774 , AF015773 ) طراحی شده اند [52 و 53] .
با این طراحی ، همان طور که با مقایسه بین آنالیز سیلیکو در مقابل همه ی اطلاعات متوالی در دسترس در پایگاه داده جاری نشان داده شده ، هر یک از پریمرها برای نوع کریپتوسپوردیا معین بود ( به وسیله Gen Bank) . PCR در حجم lµ25 شامل pmol 25 از هر پریمر ، mµ200 از 3.0mM , dNTP از mgcl2 ، lu پلیمر Gotaq ، (با بارگذاری رنگدار) (peomega) و mµ8 از رنگینه اضافه شده (Invitrogen) SYTO9 ، با شرایط سیکل گرمایی زیر انجام شد : c°94 ، 5 دقیقه (تقلیب اولیه) ، با 40 سیکل c°94 و 30 ثانیه ادامه پیدا می کند (تقلیب) ، c°53/30 ثانیه (بازپخت) و c°68/s30 (انبساط) ، با انبساط نهایی در c°68 برای 10 دقیقه در یک چرخاننده گرمایی ادامه می یابد ( . . . ، Rotor-Gen ، پیکربندی HO65 ، Corbett Rescarch Pty Ltd ) .
و SYTO چون مانع PCR نمی شود و به علت پایداری افزوده اش و عملکرد آن در مقایسه با سایر رنگینه ها ، به عنوان رنگینه استفاده شد [54 و 55] . اندازه گیری های نوری در کانال بسته ( با استفاده از فیلتر دیجیتال ، با تحریک در nm479 و آشکارسازی در nm510 ) در انتهای هر مرحله انبساط ثبت شدند . تقریباً ng5-10 از DNA نوری به هر PCR اضافه شدند ؛ نمونه هایی بدون قالب DNA ای به عنوان کنترل های منفی در هر اجرای PCR وجود داشتند . کم ترین مقدار قالب های ژنومی که 2 ITS - می تواند از آن ها تقویت شود و سپس روی ژل agarose نمایان شود حدود pg 1 تا 2 تخمین زده شود (مثلا ً حدودا ً هم ارز 4 انگل )(نشان داده نشده است) . برای آزمایش کردن ویژگی cPCp 19 نمونه ی DNA ی کنترلی نیاز است که شامل DNA از مدفوع یا خون انسانی که سابقه عفونت انگلی نداشته باشد و DNA از باکتری Lactobacillus acidophilvs , Escherichiacoli و L. gasseri ، مخمر saaharomyces cerevisiae ، انگل های تک یا خته ای Giardia duodenalis و Entamoeba histolytica ؛ و کرم های انگلی S.mansoni ، Schistosoma japonicum ، Hymenolepis nana ، Taenia saginata ، T. solivan (کرم های پهن ) ، Ascaris sp ، Ancylostoma duodenale ، Necator americanus ، Strogyloides stercoralis ، oesophagostomum bifurcum ، Trichuris trichiura ( Nematoda) می شود که با این روش تقویت در ارتباطند . در ادامه ی PCR ، آنالیز منحنی ذوب امپلیکن ها که به وسیله افزایش دما از ℃65 به ℃80 با شیب متغیر افزایشی که از 0.2 شروع می شود در چرخاننده گرمایی هدایت می شوند (Rotor – Gene 6000) با تغییرات دما تغییرات در فلورانس ضبط شده و رسم می شود . آنالیز HRM با استفاده از نرم افزار 1.7.27 Rotor- Gene با متعادل سازی ناحیه های بین ℃15/65 - 65/65 و ℃50/79 – 00/80 و متوسط آستانه اطمینان حدود %90 انجام شد .

2.3 الکتروفورز ژل agarose ، پلی مرفی ترکیب یک طرفه (SSCP) و توالی DNA
شدت و کیفیت امپلیکن ها با استفاده از mM 65 از Tris-HCL T ، mM 27 از اسید برمیک ، mM 1 از اسید تترااستیک دیامین اتیلن (EDTA) ، (TBE) PH9 به عنوان بافر و یک استوانه bp100 به عنوان اندازه ساز ، روی برمید اتیدم %1.5 (w/v) که باژل های agarose بی رنگ شده ، آزمایش و بررسی شوند .
آنالیز SSCP غیر ایزوتوپی براساس روش B انجام شد (56) . امپلیکن های ITS-2 انتخاب شوند از روی ستون های کوچک پاک شده (wizard PCR prep) و در lμ 30 از شسته می شوند و سپس به ترتیب دهی خودکار مرتبط می شوند (BigDge chemistry , Applied Biosystems) و در هر دو مسیر ، از همان پریمرهایی که برای PCR استفاده شد (به طور جداگانه) استفاده می شود . علامت های توالی نوکلئوتیدی وقتی با جستجوهای تشابه پایگاه داده غیر زائد GenBank در ارتباط بود بدست آمد .
(NCBI Basic BLASTN ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BIAST )

3- نتایج . 3.10 : ویژگی پریمزها و شرایطPCR و امپلیکن ها
ویژگی مجموعه ایستر AP58SF – APITS – 2R و شرایط PCR برای توسعه محدوده ی ITS-2 با به کارگیری نمونه های مختلف DNA از خون یا مدفوع انسان (بدون اثری از عفونت انگلی) و نمونه های از محدوده ی ارگانیسم های پروکاریوتیک (باکتری) یا ایوکاریوتیک (مخمر ، تک یا فتگان ، trematodes ، cestodes و کرم های انگلی) و مراحل پیشرفته ای که در مجراهای روده ای یا مدفوع انسان اتفاق می افتد ، بنا شده است . کمترین مقدار DNA ژنومی c-parvum که با استفاده از مجموعه پریمز و به وسیله PCR قابل تقویت است ، در 1تا 2 صفحه تخمین زده شده بود که با تحقیق قبلی که با استفاده از منطقه ی کوتاهتری از ITS( به طور مشخص PITS-2 ؛ با میانجی گری ] 33[ . انجام شد سازگار بود . سپس ، ویژگی امپلیکن هایی که از نمونه های DNA ی ژنومی سوا شده ، استخراج شده اند و نمایانگر انگل های مجزا شده از c.hominis (3n=) و c-parvum (3n=) هستند ، بررسی شد . در ژل های agarose نوار دوتایی (حدود 440 و bp 450) و نوار تکی (حدود bp450) مرتبا ً و به ترتیب c.hominis و c-parvum را نشان دادند . برچسب های زنجیره (> bp 200) با استفاده از پریمزهای AP58SF یا APITS – 2R از بین همه ی امپلیکن های ITS-2 (مستقیما ً) معین شدند و مقایسه زنجیره اطلاعات با آن ها در پایگاه داده جاری (AJ539190، Aj 539200، AJ539216، AJ539217، AFO93011، AFO93012) هویت مشخص هر امپلیکن را تایید کرد .

3.2 . تشخیص تغییر پذیری های سنجش داخلی و سنجش میانی
با اثبات ویژگی ها، امپلیکن ها و شرایط PCR ، گام بعدی شناسای شخصیت ذوب امپلیکن های ITS-2 از c.hominis یا c-parvum بود . امپلیکن هایی که نشان دهنده نمونه های DNA ی کنترلی مرجع c.hominis (3 n= ؛ کدهای ch1 ، ch2 ، ch3 ) و c-parvum (3n= ؛ کدهای cp1 ، cp2 ، cp3 ) بودند ، در ابتدا برای برقراری سازگاری (تکرارپذیری) منحنی های ذوب برای نمونه ها در طول یک اجرا و در طول کل اجراها به کار گرفته شدند . (در پنج روز مختلف انجام شد .) ارزیابی دقیق تغییر پذیری های سنجش داخلی و سنجش میانی (کوواریانس) با محاسبه ی میانگین و کوواریانس دمای ذوب در طول 10 تکرار از هر یک از سه نمونه در یک اجرا و در طول پنج اجرا ، انجام شد . برای منحنی 1 (c.hominis) ، ضریب های سنجش داخلی تغییر (واریانس) برای اولین نقطه ای اوج ذوب 0.04 (ch1) ، 0.08 (ch2) ، 0.05(ch3) و برای دومین نقطه ذوب 0.06 (ch1) ، 0.10 (ch2) ، 0.09 (ch3) بودند . برای منحنی 2 (c-parvum ) ، ضرایب سنجش داخلی تغییر (واریانس) ، 0.11 (cp1) ، 0.01 (cp2) 0.02(cp3) بودند . برای منحنی 1 (c.hominis) ، ضرایب های سنجش میانی تغییر (واریانس) ، 0.14 (ch1) ، 0.16 (ch2) ، 0.15 (ch3) برای اولین نقطه ذوب و برای دومین نقطه اوج ذوب ،0.25 (ch1) ، 0.16 (ch2) ، 0.12 (ch3) بودند . برای منحنی 2 (c-parvum) ، ضرایب های سنجش میانی تغییر (واریانس) ، 0.32 (cp1) ، 0.22 (cp2) 0.19(cp3) بودند .
شکل 1. منحنی های معرف در آنالیز منحنی ذوب امپلیکن های ITS-2 برای c.hominis (قرمز)،
c-parvum (آبی) یا c.meleagridis (سیاه) (بالایی) ، و منحنی های هنجار شده (نرمال شده) از همان اطلاعات (در پایین) .
جدول 1 . نتایج بدست آمده از DNA ژنومی از کریپتوسپوریدیای مجزا شده از انسان های مبتلا به کریپتوسپوریدیا به وسیله آنالیز منحنی ذوب جفت شده با PCR امپلیکن ITS-2 ، و تعدادی نمونه با منحنی خاص .
بنابراین ، ارزیابی های گسترده تغییرپذیری های سنجش داخلی ومیانی را به ترتیب <%1.5 و %3.5 نشان داد . 3.3 دسته بندی نمونه ها بر مبنای آنالیز منحنی ذوب : در ادامه ، همه ی نمونه های آزمایشی DNA ی کریپتوسپوریدیا مربوط به آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR بودند ( شکل 1 . cf) . دسته بندی خاص نمونه ها (جدول 1) با نتایجی که قبلا ً به وسیله ترتیب دهی جفت شده با SSCP ی SSU بدست آمده ، مطابقت داشت .] 30،31[ . در این تحقیق ، منحنی های ذوب به وسیله ی نقطه ی اوج های ℃0.33± 72.47 و ℃0.45 ± 74.19 (منحنی 1) ، ℃0.32 ± 72.17 (منحنی 2) و ℃0.03 ± 73.33 (منحنی 3) مشخص شدند (جدول 1) . امپلیکن هایی که از نمونه های منتخب برای نمایش منحنی 1 (کدهای 10 ch ، 48 ch ، 69 ch ، 93 ch ، 94 ch ) ، منحنی 2 ( کدهای (1cp ، 23cp ، 24cp ، 75cp ، 100cp ) ، و منحنی 3 ( کد 89 cm ) بودند ، به صورت تکه ای زنجیره ای ، و بر مبنای مقایسه با زنجیره های منتخب از پایگاه داده جاری (اعداد در دسترس AFO93012 ، AJ539190، AJ 539200، AJ539217، AJ539216 ، AFO93011، AFO381167) بودند ؛] 33،53،57[ ، به ترتیب برای نمایش c.hominis ، c-parvum و c.meleagridisنشان داده شده اند . وجود دو نقطه ی اوج در منحنی 2 ، به دلیل وجود دو گونه زنجیره اندازه ITS-2 (اختلاف در حدود bp 10) در امپلیکن ها خارج شده از c.hominis بود ؛ وجود دو نوع غالب توالی سازگار با یافته های مطالعه الکتروفورزی قبلی بود . ] 33[
برای هر یک از سه نوع کریپتوسپوریدیا ، منحنی فلورانس نرمال شده از آنالیز HRM (شکل 1 ، پایینی) ، که در آن کاهش تندی در فلوئورنس ثبت شد ، با منحنی ذوب مربوط به آن سازگار بود (شکل 1 ، بالایی) .

4. مباحث و نکات پایانی :
1 اندازه ی امپلیکن های ITS-2 (bp 450 -440) استفاده شده در آنالیزهای کنونی بزرگتر از آن هایی بودند که معمولا ً برای آنالیز منحنی ذوب استفاده می شدند ، بنابراین کاهش احتمالی ظرفیت آشکارسازی جهش وجود داشت ولی با این حال ، هویت مشخص و تفکیک نمونه ها به دست آمد . در واقع ، مطالعات مختلف نشان داده است ] 54-5-58-60[ که منحنی های ذوب دارای چند نقطه اوج ( مثل c.hominis ) می تواند تجدید پذیر باشد ]54[ و نمایش نقاط اوج مختلف مشخصا ً ، برای تهیه یک منحنی واحد با تعداد افزایشی کاراکترها برای تفکیک انواع و یا ژنوتیپ ها ، مفید است . برای مثال ، رابینسون و ... ]59[ آنالیز منحنی ذوب رابرای فرق گذاشتن بین هفت نوع Naegleria ( protista) ، و تفکیک از ارتباط با willaertia magna ، با استفاده از امپلیکن های منفرد ( حدود bp 400-330) که نشان دهنده ی ITS-1 ، S 5.8 ITS-2 , ی DNA ی هسته ای است ، استفاده کردند . به طور مشابه ، راسموسن (Rasmussen) و ... ] 60[ این روش را برای تفکیک c-parvumاز c.muris با استفاده از یک سازنده (حدود bp 300) در داخل SSU ی DNA ی هسته ای استفاده کردند . این مولف ها ، همچنین ، برنامه های کامپیوتری POLAND (http://www.biophys.uni – duessel dorf .de / local / POLAND / Poland . html ) و MELTSIM (http:// ftp. Bioinformatics.org/pub/meltsim ) را ارزیابی کردند و آن ها را برای پیش بینی کردن منحنی های ذوب که بر اساس اطلاعات زنجیره ای DNA می باشند ، مفید دانستند . در پیش بینی silico ، وقتی که برای محدوده ی ITS-2 از انواع کریپتوسپوریدیا به کار گرفته می شوند ، ممکن است محدودیتی وجود داشته باشد ، چون منحنی واقعی ذوب یک امپلیکن ITS-2 (از یک نوع یا انواع ) ، مخلوطی از محدوده های ذوب متعدد برای انواع مختلف زنجیره در یک امپلیکن را نشان می دهد ( ] 33[ را ببینید) . در آزمایشگاه ، یک منحنی مرکب ممکن است در ارتباط با تغییرات دقیقی با شد چون بعضی گرایشات در تقویت انواع زنجیره های انتخاب شده در PCR تحت شرایط خاصی است . به هر حال ، تهیه مکان هندسی در انواع منحصر به فرد ( و فراوانی انگل ها) به قدر کفایت همگن است .
در میان گونه ها در توالی مختلف است ، انتظار می رود روش مجازی ]60[ برای منحنی های ذوب پیش بینی شده برای گونه ها ی منحصر به فرد کریپتوسپوریدیا مفید باشد و حتی ممکن است در پیش بینی آنهایی که به عفونت های انواع درهم آمیخته وابسته اند ، کمک کند .
تعدادی از تحقیقات قبلی عفونت های درهم شده ی c.hominis ، c-parvum در انسان هایی که از روش های فنتیک (phonetic) استفاده کرده اند ، را گزارش کرده اند ( برای مثال : PCR بر مبنای پولیمورفیسم طولی تکه ای اعضاری یا PCR های خاص ] 61-67[ ) ولی در همه ی موارد ، وجود هر نوع در امپلیکن ها به وسیله زنجیره DNA مستقیم ثابت نشد . در تحقیق کنونی ، آنالیز منحنی ذوب وصل شده به PCR نمونه ها ( شکل 2) (بر مبنای آنالیز SSCP قبلی ) شامل بودن DNA ی c.hominis ، c-parvum و c.hominis + c-parvum را اثبات کرد و معلوم کرد که این روش ظرفیت آشکارسازی عفونت های مخلوط شده را دارد . به هر حال ، بر اساس یافته های منتشر نشده ، انتظار نمی رود که آنالیز منحنی ذوب حساسیت و دقتی را که SSCP برای آشکار سازی بصری هر دوی c.hominis ، c-parvum در نمونه ها دارد ، بدست بیاورد ( ]33 و 56[ را ببینید ) . این محدودیت پنهان ، ممکن است با اتصال کاربرد PCR پشت سر هم مرکب ]68[ یا PCR کاوشگر ]69[ به آنالیز HRM از بین برود . در پایان ، روش آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR کنونی برای نمایش سریع تعداد زیادی از نمونه های DNA ی انگل کریپتوسپوریدیا مناسب است . این روش ، اگرچه کیفی است ، علاوه بر روش های الکتروفورزی ]32-34[ مزیت های دیگری خصوصا ً در ارتباط با زمان آنالیز ، عملکرد نمونه ها و ذخیره اطلاعات و ظرفیت های آنالیز دارد . نیازی به ریختن ، جابه جایی و یا بررسی ژل های الکتروفورزی نیست ، بنابراین کاهش قابل توجهی در زمان و نوینه می باشد . همچنین ، منحنی ذوب به طور اتوماتیک ضبط شده و به صورت الکتونیکی ذخیره می شوند (به صورت صفحه های گسترده) و می توانند در هر زمان برای آنالیز های مقایسه ای بازیابی شوند . اگرچه روش کندی بر مبنای استفاده از یک نشان گر ژنتیکی است ، نشان گرهای دیگر (از 100 تا bp 450) تغییر زنجیره ها را نشان می دهند . که بین گونه ها بزرگتر از داخل گونه ها است و باید قابل استفاده برای گونه های مختلف کریپتوسپوردیا باشد . بنابراین ، آنالیز منحنی کنونی ، با به کارگیری نشان گر DNA ی کنونی ، باید ابزارهای کاربردی برای تشخیص ، بررسی شیوع عفونت های کریپتوسپوریدیا از مناطق جغرافیایی خاص و برای نمایش بروز کریپتوسپوریدیا تهیه کنند . اگرچه این روش برای تشخیص عفونت با c.hominis ، c-parvum یا c.meleagridis استفاده شد ، طراحی پریمرهایی که در خاصیت و وسعت به خوبی تغییر زنجیره در ITS-2 ]35[ باشند ، این گونه ها و گونه های دیگر کریپتوسپوریدیا را که از محدوده ی شکمی شامل آب ، غذا ، خاک و مدفوع مجزا باشند ، نشان می دهد ؛ این موضوع تحقیقات بیشتری را نیاز دارد . روش های مشابه آنالیز منحنی ذوب متصل به PCR باید قابل اجرا برای محدوده ای از عامل های بیماری زای پروکاریوتیک و اِیوکاریوتیک کلیدی باشند ، در صورتیکه نشان گرهای DNA ی مناسب به کار برد .
شکل 2 : یک نمونه از آنالیز منحنی ذوب فرآورده های PCR منحصر به فرد که از DNA ی ژنومی (حدود 5 تا ng 10) هر یک از c.hominis (قرمز) ، c-parvum (آبی یا c-parvum + c.hominis (سبز) تولید شده است و از یک نمونه که از ترکیب (با نسبتهای مساوی) دو فرآوده که نشان دهنده c.hominis ، c-parvum (صورتی) است بدست می آید . امپلیکن ها مربوط به آنالیز پولی مورفیسم شکل بندی تک کرانه ای SSCP بودند که از قبل آنالیز منحنی ذوب بود ]33 و 37[ تا وجود نوارهایی که نشان دهنده ی هر دوی c.hominis ، c-parvum بود را در نمونه های گونه های مخلوط شده تخمین کند . (سبز و صورتی) .

قدردانی
تشکرهای صادقانه از Annkoehlor و سازمان بهداشت ، به دولت استرالیای جنوبی (برای تهیه بعضی نمونه هاکه در این جا استفاده شد .) و از امید نور محمدی برای دسترسی به چرخاننده گرمایی ، از Garry Anlerson برای تشریح مطالب و از Corbett life برای حمایت هایش . از سرمایه گذاری Melbourne Water Comporation ، the Australian Research Council (ARC) و American Fulbright commission - the Australian قدردانی می شود .

فرمت این مقاله به صورت Word و با قابلیت ویرایش میباشد

تعداد صفحات این مقاله  12  صفحه

پس از پرداخت ، میتوانید مقاله را به صورت انلاین دانلود کنید

بررسی منحنی های اندرکنش درستونهای بتنی مقاومسازی شده با FRP

اختصاصی از زد فایل بررسی منحنی های اندرکنش درستونهای بتنی مقاومسازی شده با FRP دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .